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lisosomiale indotta nel tessuto di accumulo di grasso periferico sovraregola la via di segnalazione dei neuropeptidi nel sistema nervoso per promuovere la longevità.Questa regolazione cellulare non autonoma è mediata da uno specifico acido grasso polinsaturo, acido diomo-γ-linolenico e proteina chaperone lipidica LBP-3 trasportata dal tessuto di accumulo di grasso ai neuroni.LBP-3 si lega all'acido diomo-γ-linolenico e agisce attraverso il recettore nucleare NHR-49 e il neuropeptide NLP-11 nei neuroni per prolungare la durata della vita.Questi risultati rivelano che i lisosomi sono un hub di segnalazione per coordinare il metabolismo e l'invecchiamento, e la comunicazione tra i tessuti mediata dalla segnalazione lisosomiale nel promuovere la longevità.L'invecchiamento è un processo di progressivo declino che si verifica a tutti i livelli.I meccanismi che regolano la diafonia tra diversi organelli e tra diversi tessuti contribuiscono alla regolazione della longevità1,2,3.In particolare, i lipidi sono segnali cruciali nella mediazione della diafonia degli organelli e delle interazioni tissutali1,4,5 e l'integrazione alimentare di lipidi specifici influenza la durata della vita6,7.I lisosomi partecipano attivamente al metabolismo lipidico e la scomposizione lipidica da parte delle lipasi acide lisosomiale rilascia acidi grassi liberi (FFA) dai triacilgliceroli (TAG) e dagli esteri del colesterolo (CE)8.I lisosomi fungono anche da hub di segnalazione all'interno della cellula.In Caenorhabditis elegans, LIPL-4 è una lipasi acida lisosomiale espressa specificamente nell'intestino, il tessuto periferico di accumulo di grasso.È sovraregolato a digiuno9,10 e nel mutante di lunga durata che riduce la segnalazione di insulina/IGF-1 (IIS) o manca della linea germinale1,10,11.Nell'intestino, l'induzione di lipl-4 attiva una via di segnalazione lipidica retrograda lisosoma-nucleo per regolare la trascrizione e i mitocondri, portando ad un aumento della lipolisi e della durata della vita1,12.Finora, il ruolo di segnalazione dei lisosomi nella comunicazione tra i tessuti rimane sconosciuto.In questo articolo, riveliamo che la lipolisi lisosomiale indotta da LIPL-4 nel tessuto di accumulo di grasso periferico sovraregola l'acido diomo-γ-linolenico (DGLA), che si lega a una proteina chaperone lipidica secreta, LBP-3 e cellula-non autonomamente induce la via di segnalazione del neuropeptide per promuovere la longevità.A valle della segnalazione lipidica LIPL-4-LBP-3, il recettore nucleare NHR-49, un omologo di C. elegans di PPARα, agisce specificamente nei neuroni e media l'induzione trascrizionale dei geni neuropeptidi e l'effetto pro-longevità.Questi studi rivelano che i segnali derivati ​​dal lisosoma sono cruciali non solo per la diafonia organica nella cellula12, ma anche per la coordinazione dei tessuti nell'organismo, rendendoli bersagli interessanti per un intervento ottimale di pro-longevità a livello sistemico.Per prima cosa abbiamo profilato sistematicamente i cambiamenti trascrizionali associati alla lipolisi lisosomiale indotta da LIPL-4 utilizzando l'analisi del sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) di vermi transgenici lipl-4 (lipl-4 Tg), che esprimono costitutivamente questa lipasi nell'intestino e hanno una durata della vita estesa ( Fig. 1a e Tabella Supplementare 4).Una serie di geni è espressa in modo differenziale in lipl-4 Tg rispetto ai vermi di tipo selvaggio (WT) (cambiamento di piega> 1, 5, P <0, 05; Tabella 1 supplementare e analisi PCA in dati estesi Fig. 1a).L'annotazione funzionale DAVID dei geni sovraregolati in lipl-4 Tg ha rivelato l'arricchimento di distinti processi biologici (Fig. 1b).Oltre alle categorie di "risposta immunitaria" e "risposta di difesa" che sono comunemente associate alla longevità, abbiamo scoperto l'arricchimento della "via di segnalazione dei neuropeptidi", che consiste in geni che codificano per neuropeptidi e i loro enzimi di elaborazione.Abbiamo utilizzato la PCR quantitativa con trascrizione inversa (qRT-PCR) per confermare l'induzione dei geni di elaborazione dei neuropeptidi egl-3, egl-21, pgal-1/pghm-1 e sbt-1 (Fig. 1c), che codificano per la convertasi neuroendocrina , carbossipeptidasi E, peptidilglicina α-amidante monoossigenasi e chaperone neuroendocrino 7B2, rispettivamente (Fig. 1d).Tra questi, egl-21, pgal-1 e pghm-1 sono specificamente espressi nei neuroni13,14.Le loro induzioni suggeriscono una regolazione cellulare non autonoma dei geni neuronali mediante lipolisi lisosomiale periferica.Esistono anche neuropeptidi sovraregolati trascrizionalmente in lipl-4 Tg, inclusi 3 peptidi simili all'insulina (ILP), 12 peptidi correlati a FMRFamide (FLP) e 19 proteine ​​​​simili ai neuropeptidi (NLP) (Fig. 1e e Tabella supplementare 1).a, I ceppi transgenici che esprimono costitutivamente lipl-4 nell'intestino (lipl-4 Tg) mostrano un'estensione della durata della vita.b, Ontologia genica dei geni sovraregolati in lipl-4 Tg rispetto ai vermi WT.c, i geni che codificano per gli enzimi di elaborazione dei neuropeptidi egl-3, egl-21, sbt-1, pgal-1 e pghm-1 sono sovraregolati trascrizionalmente da lipl-4 Tg.d, Diagramma schematico del percorso di elaborazione e maturazione dei neuropeptidi.e, Elenco di geni neuropeptidi significativamente sovraregolati (P ​​<0,05) da lipol-4 Tg nel profilo del trascrittoma RNA-seq.f, l'mRNA di egl-21 viene rilevato da smFISH (Red Quasar 670), mentre i nuclei sono colorati da DAPI.egl-21 viene rilevato nei neuroni (regione inscatolata) di WT ma non nei vermi egl-21(lf).La regione dell'intestino contrassegnata da linee tratteggiate non mostra egl-21.Barra della scala, 30 µm e 10 µm nel riquadro.g, GFP guidato dal promotore endogeno egl-21 è espresso nei neuroni ma non nell'intestino (contrassegnato da linee tratteggiate).Barra della scala, 10 µm.h, La mutazione con perdita di funzione di egl-21(lf) sopprime la longevità del lipl-4 Tg.daf-16 RNAi knockdown viene utilizzato per eliminare l'influenza dalla riduzione dell'ILP in egl-21 (lf).In a e h, n = 3 campioni biologicamente indipendenti;NS, non significativo (P > 0,05), ***P < 0,001 per log-rank test, 60–120 worm per replica.Vedere le tabelle supplementari 4 e 5 per i dati sulla durata della vita completa.In c, le barre di errore rappresentano l'errore medio ± standard della media (sem), n = 3 campioni biologicamente indipendenti, ****P < 0,0001 dal test t di Student a due code, ~ 2.000 vermi per replica.In e, le barre di errore rappresentano la media ± sem, n = 3 campioni biologicamente indipendenti, DESeq2 |fold change|≥1,5;P < 0,05 per test Wald a due code (lipl-4 Tg contro WT), ~ 3.000 vermi per replica.I dati numerici di origine sono disponibili nei dati di origine.Successivamente, abbiamo esaminato il ruolo della via di segnalazione del neuropeptide nella regolazione della longevità utilizzando il mutante di perdita di funzione di egl-21, egl-21(lf).L'enzima EGL-21 è necessario per l'elaborazione del neuropeptide rimuovendo i residui di base dal C-terminale dei peptidi scissi15 e il gene egl-21 è espresso esclusivamente nei neuroni come visualizzato sia dall'ibridazione in situ a fluorescenza a singola molecola (smFISH) che dalla sua reporter transgenico di proteina fluorescente verde (GFP) (Fig. 1f, g).Abbiamo scoperto che lipl-4 Tg non può prolungare la durata della vita di egl-21 (lf) (dati estesi Fig. 1b e Tabella supplementare 4), suggerendo che l'induzione della segnalazione del neuropeptide contribuisce alla longevità indotta da lipl-4.Precedenti schermate di interferenza dell'RNA genomico (RNAi) hanno rilevato che l'inattivazione di egl-3, che codifica per la convertasi a monte di EGL-21, prolunga la durata della vita, che viene soppressa dall'inattivazione del fattore di trascrizione daf-16/FOXO16.Allo stesso modo, abbiamo scoperto che egl-21 (lf) ha una durata della vita estesa e questa estensione della durata della vita richiede daf-16 (Dati estesi Fig. 1c e Tabella 5 supplementare).Dato che le ILP regolano la durata della vita17,18 e DAF-16/FOXO è il mediatore chiave della longevità causata dalla riduzione di IIS19, il requisito di DAF-16 suggerisce che l'effetto di longevità conferito da egl-21(lf) sia probabilmente dovuto alla riduzione dell'ILP agonista maturazione e IIS.Al contrario, l'estensione della durata della vita in lipl-4 Tg non è soppressa da daf-16 RNAi (dati estesi Fig. 1d e Tabella supplementare 5), indicando un ruolo trascurabile degli ILP per la longevità indotta da lipl-4.Questi risultati suggeriscono che, al fine di verificare se la riduzione di NLP o FLP in egl-21(lf) influisce sulla longevità indotta da lipl-4, dovremmo inattivare daf-16 per eliminare il contributo dalla riduzione dell'ILP.Abbiamo scoperto che, con daf-16 RNAi, egl-21 (lf) abroga completamente l'estensione della durata della vita conferita da lipol-4 Tg (Fig. 1h e Tabella 5 supplementare).Insieme, questi risultati suggeriscono che l'elaborazione dei neuropeptidi è necessaria affinché la lipolisi lisosomiale intestinale promuova la longevità, che è probabilmente associata a NLP e/o FLP ma non a ILP.Per identificare i neuropeptidi specificamente coinvolti, abbiamo eseguito uno schermo basato su RNAi per cercare i geni che codificano i neuropeptidi la cui inattivazione sopprime l'estensione della durata della vita in lipl-4 Tg (Tabella supplementare 3).Abbiamo scoperto che l'inattivazione dell'RNAi di nlp-11 in uno sfondo neuronale sensibile all'RNAi sopprime la longevità del lipl-4 Tg senza influire sulla durata della vita del WT (Fig. 2a e Tabelle supplementari 3 e 5).Abbiamo inoltre generato un mutante di eliminazione di brevi ripetizioni palindromiche (CRISPR) raggruppate regolarmente interspaziate per nlp-11, nlp-11 (lf) (dati estesi Fig. 2a) e l'abbiamo incrociato con lipl-4 Tg.Abbiamo scoperto che nlp-11 (lf) riduce l'estensione della durata della vita in lipl-4 Tg ma non la durata della vita WT (Fig. 2b e Tabella 4 supplementare).nlp-11 è sovraregolato trascrizionalmente in lipl-4 Tg (Dati estesi Fig. 2b) e la sovraespressione di nlp-11 guidata dal suo promotore endogeno prolunga sufficientemente la durata della vita (Fig. 2c, Dati estesi Fig. 2c e Tabella supplementare 4).nlp-11 esprime sia nei neuroni che nell'intestino (dati estesi Fig. 2d).Per esaminare dove nlp-11 funziona per regolare la longevità, abbiamo abbattuto nlp-11 selettivamente nell'intestino e abbiamo scoperto che questa inattivazione del solo intestino non influisce sull'estensione della durata della vita in lipl-4 Tg (Fig. 2d e Tabella 5 supplementare).Abbiamo anche sovraespresso nlp-11 nei neuroni o nell'intestino utilizzando promotori tessuto-specifici e abbiamo scoperto che solo la sovraespressione specifica del neurone di nlp-11 è sufficiente per prolungare la durata della vita (Fig. 2e, f, Dati estesi Fig. 2e, f e Supplementare tabella 4).Insieme, questi risultati dimostrano che l'nlp-11 neuronale è specificamente responsabile dell'effetto di longevità conferito dalla lipolisi lisosomiale intestinale.a, Atterramento di nlp-11 in uno sfondo neuronale sensibile all'RNAi sopprime la longevità del lipl-4 Tg.b, la mutazione con perdita di funzione di nlp-11(lf) sopprime la longevità del lipl-4 Tg.c, L'espressione costitutiva di nlp-11 guidata dal suo promotore endogeno estende la durata della vita.d, RNAi knockdown di nlp-11 selettivamente nell'intestino non mostra alcuna soppressione della longevità del lipl-4 Tg.e, f, la sovraespressione specifica del neurone di nlp-11 prolunga la durata della vita (e), ma la sovraespressione specifica dell'intestino non ha tale effetto (f).In a–f, n = 3 campioni biologicamente indipendenti, *** P < 0,001 per log-rank test, 60–120 vermi per replicato, EV, controllo vettoriale vuoto per RNAi.Viene mostrata la durata della vita di un ceppo transgenico (n. 1) e gli altri sono nei dati estesi Fig. 2. Vedere le tabelle supplementari 4 e 5 per i dati sulla durata della vita completa.La lipasi acida lisosomiale catalizza il rilascio di FFA da TAG e/o CE8.Attraverso il profilo lipidomico degli FFA, abbiamo scoperto che i livelli di acidi grassi polinsaturi (PUFA) sono aumentati in lipol-4 Tg (Fig. 3a).Per verificare se questi PUFA derivano dalla lipolisi lisosomiale, abbiamo purificato i lisosomi e profilato diverse classi di lipidi.Abbiamo scoperto che, rispetto a WT, il livello di TAG è ridotto di circa tre volte nei lisosomi purificati da Lipl-4 Tg (Dati estesi Fig. 3a).Inoltre, 186 delle 305 specie TAG rilevate (61%) sono diminuite nei lisosomi lipl-4 Tg, con il 63% di esse contenente PUFA (Fig. 3b).Questi risultati suggeriscono che l'induzione dei PUFA è probabilmente dovuta all'aumentata lipolisi lisosomiale dei TAG.a, I livelli relativi di FFA, acidi grassi saturi (SFA), MUFA e PUFA sono quantificati mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa in lipl-4 Tg rispetto a WT.b, Percentuale di specie lipidiche che mostrano cambiamenti significativi (P <0,05) nel lisosoma purificato da lipl-4 Tg rispetto ai vermi WT.Su 186 specie TAG diminuite in lipl-4 Tg, 117 contengono PUFA.Sfingofosfolipidi (SPH), fosfatidilcoline (PC), lisofosfatidilcoline (LPC), fosfatidiletanolammine (PE), lisofosfatidiletanolammine (LPE), fosfatidilserina (PS), lisofosfatidilserina (LPS), fosfatidilinositolo (PI), diacilgliceroli (DAG) e TAG.c, Diagramma schematico della biosintesi dei PUFA in C. elegans.I PUFA arricchiti in Lipl-4 Tg sono evidenziati in blu, mentre gli enzimi desaturasi sono contrassegnati in verde.d, La mutazione con perdita di funzione dell'acido grasso desaturasi fat-1(lf) o fat-3(lf) sopprime la sovraregolazione trascrizionale dei geni neuropeptidi egl-3 ed egl-21 da parte di lipol-4 Tg.e, f, il knockdown RNAi di grasso-1 (e) o grasso-3 (f) selettivamente nell'intestino sopprime la longevità del lipl-4 Tg.In a, le barre di errore rappresentano la media ± sem, n = 6 (WT) e n = 9 (lipl-4 Tg) campioni biologicamente indipendenti, *P = 0,028 per C18:4n3, P = 0,023 per C14:0 e P = 0,026 per C15:0, **P = 0,007 per C18:2n6 e P = 0,002 per C18:3n3/6, ****P < 0,0001 per C16:1n7, C20:2n6, C20:3n6 e C20:4n6 di due -way ANOVA con correzione Holm-Sidak (lipl-4 Tg contro WT), ~ 40.000 worm per replica.In d, le barre di errore rappresentano la media ± sem, n = 4 (WT, fat-1(lf), fat-3(lf) e lipl-4 Tg;fat-1(lf)) e n = 3 (lipl-4 Tg e lipl-4 Tg; fat-3 (lf)) campioni biologicamente indipendenti, *** P < 0, 001 mediante ANOVA a due vie con correzione Holm-Sidak, ~ 3.000 vermi per replica.In e e f, n = 3 campioni biologicamente indipendenti, *** P < 0,001 per log-rank test, 60–120 worm per replica.Vedere la tabella supplementare 5 per i dati sulla durata della vita completa.I dati numerici di origine sono disponibili nei dati di origine.Per verificare l'ipotesi che questi PUFA servano come segnali cellulari non autonomi per regolare i neuropeptidi, abbiamo utilizzato mutanti con perdita di funzione di grasso-1 e grasso-3 che codificano rispettivamente le desaturasi degli acidi grassi ω-3 e la Δ6-desaturasi, richieste per la biosintesi dei PUFA20 (Fig. 3c).Con questi mutanti della desaturasi, la sovraregolazione dei geni neuropeptidi (Fig. 3d) e l'estensione della durata della vita sono soppresse in lipl-4 Tg (Dati estesi Fig. 3b, c e Tabella 4 supplementare).FAT-1 e FAT-3 funzionano nell'intestino e nei neuroni per catalizzare localmente la biosintesi dei PUFA21,22.Abbiamo ridotto selettivamente i PUFA intestinali abbattendo il grasso-1 e il grasso-3 solo nell'intestino e abbiamo scoperto che l'inattivazione del solo intestino di grasso-1 o grasso-3 abroga completamente l'estensione della durata della vita in lipl-4 Tg (Fig. 3e, f e Tabella Supplementare 5).Insieme, questi risultati suggeriscono che i PUFA derivati ​​dalla lipolisi lisosomiale intestinale mediano sia l'induzione dei neuropeptidi che la longevità.Gli FFA hanno una bassa solubilità in acqua e devono essere legati alle proteine ​​per diffondersi nell'ambiente lipofobico.Una famiglia di proteine ​​denominate proteine ​​leganti gli acidi grassi (FABP) funzionano come accompagnatori lipidici, che legano reversibilmente gli FFA e i loro derivati ​​per mediarne il traffico e gli effetti di segnalazione23,24.Abbiamo testato se FABP specifici facilitano l'azione dei PUFA intestinali sui neuroni e ci siamo concentrati su tre FABP, LBP-1, LBP-2 e LBP-3, che trasportano segnali secretori putativi.Abbiamo scoperto che l'inattivazione di RNAi di lbp-2 o lbp-3 ma non lbp-1 sopprime specificamente l'induzione dei geni neuropeptidi causati da lipl-4 Tg (dati estesi Fig. 4a, b).Per confermare i risultati del knockdown dell'RNAi, abbiamo generato mutanti di eliminazione CRISPR di lbp-2 e lbp-3 (dati estesi Fig. 4c) e li abbiamo incrociati con lipl-4 Tg.Abbiamo scoperto che solo l'eliminazione di lbp-3 ma non lbp-2 sopprime l'induzione dei geni neuropeptidi (Fig. 4a).L'eliminazione di lbp-3 sopprime anche la longevità del lipl-4 Tg senza influire sulla durata della vita del WT (Fig. 4b e Tabella 4 supplementare).a, La mutazione con perdita di funzione del chaperone lipidico lbp-3 (lf) ma non lbp-2 (lf) sopprime la sovraregolazione trascrizionale di egl-3 ed egl-21 da parte di lipl-4 Tg.b, lbp-3(lf) sopprime la longevità del lipl-4 Tg.c, l'espressione costitutiva di lbp-3 guidata dal proprio promotore endogeno (lbp-3 Tg) prolunga la durata della vita.d, I livelli trascrizionali di egl-3, egl-21 e nlp-11 sono indotti nei vermi lbp-3 Tg.e, Su 39 geni neuropeptidi sovraregolati da lipol-4 Tg, 22 sono anche significativamente indotti da lbp-3 Tg (P <0,05).f, la mutazione con perdita di funzione di egl-21(lf) sopprime la longevità di lbp-3 Tg.daf-16 RNAi knockdown viene utilizzato per eliminare l'influenza dalla riduzione dell'ILP in egl-21 (lf).g, la mutazione con perdita di funzione di nlp-11(lf) sopprime la longevità di lbp-3 Tg.h, la sovraespressione di lbp-3 specifica per l'intestino sovraregola i livelli trascrizionali di egl-3, egl-21 e nlp-11.i, la sovraespressione di lbp-3 selettivamente nell'intestino prolunga la durata della vita.In a, le barre di errore rappresentano la media ± sem, n = 3 (lbp-2(lf), lipl-4 Tg e lipl-4 Tg; lbp-2(lf)) e n = 6 (WT, lbp-3(lf ) e lipl-4 Tg; lbp-3 (lf)) campioni biologicamente indipendenti, *** P = 0, 0001 mediante ANOVA a due vie con correzione Holm-Sidak, ~ 2.000 vermi per replica.In b, c, f, g e i, n = 3 campioni biologicamente indipendenti, *** P < 0,001 mediante test log-rank, 60–120 vermi per replica.Viene mostrata la durata della vita di un ceppo transgenico (n. 1) e gli altri sono nei dati estesi Fig. 4. Vedere le tabelle supplementari 4 e 5 per i dati sulla durata della vita completa.In d, le barre di errore rappresentano la media ± sem, n = 5 (WT e lbp-3 Tg per egl-3 e nlp-11) e n = 3 (WT e lbp-3 Tg per egl-21) campioni biologicamente indipendenti, * *P = 0,007 per egl-3, **P = 0,007 per nlp-11 e ***P = 0,0002 per egl-21 mediante ANOVA a due vie con correzione Holm-Sidak, ~2.000 worm per replica.In h, le barre di errore rappresentano la media ± sem, n = 4 campioni biologicamente indipendenti, * P = 0, 0497, **** P < 0, 0001 mediante ANOVA a due vie con correzione Holm-Sidak, ~ 2.000 vermi per replica.I dati numerici di origine sono disponibili nei dati di origine.Abbiamo anche scoperto che i ceppi transgenici che esprimono costitutivamente lbp-3 (lbp-3 Tg) vivono più a lungo dei vermi WT (Fig. 4c, Dati estesi Fig. 4d e Tabella 4 supplementare) e mostrano sovraregolazione di egl-3, egl-21 e nlp-11 (Fig. 4d).Abbiamo ulteriormente profilato le modifiche del trascrittoma in lbp-3 Tg utilizzando RNA-seq (Tabella supplementare 2 e analisi PCA in dati estesi Fig. 4e).Tra i 39 geni neuropeptidi sovraregolati in lipl-4 Tg, tutti i 5 geni di elaborazione dei neuropeptidi e 16 geni neuropeptidi sono stati sovraregolati in lbp-3 Tg (Fig. 4e e Tabella Supplementare 2).Simile a lipl-4 Tg, l'estensione della durata della vita conferita da lbp-3 Tg non viene soppressa da daf-16 RNAi (dati estesi Fig. 4f e Tabella supplementare 5), ma è soppressa da egl-21 (lf) nel daf -16 Sfondo RNAi (Fig. 4f e Tabella 5 supplementare).Inoltre, l'inattivazione di nlp-11 sopprime parzialmente l'estensione della durata della vita in lbp-3 Tg (Fig. 4g e Tabella 4 supplementare).Questi risultati supportano che neuropeptidi specifici agiscono a valle della segnalazione LIPL-4-LBP-3 per regolare la longevità.Successivamente, abbiamo scoperto che i ceppi transgenici che sovraesprimono selettivamente lbp-3 nell'intestino mostrano la sovraregolazione dei geni neuropeptidi (Fig. 4h) e l'estensione della durata della vita (Fig. 4i, Dati estesi Fig. 4g e Tabella 4 supplementare).Insieme, questi risultati supportano il fatto che lo specifico chaperone lipidico LBP-3 media la comunicazione grasso-neurone per regolare i neuropeptidi e la longevità.Per comprendere ulteriormente la funzione di LBP-3 in questa regolazione endocrina, abbiamo esaminato se LBP-3 può essere secreto dall'intestino.In C. elegans, i celomociti sono cellule scavenger che assorbono i materiali secreti dalla cavità corporea e fungono da monitor delle proteine ​​secrete25.Abbiamo generato un ceppo transgenico che esprime un trascritto policistronico specifico dell'intestino che codifica sia la fusione della proteina fluorescente rossa (RFP) LBP-3 che la GFP, in modo tale che GFP indichi le cellule che esprimono lbp-3 e RFP etichetti direttamente la proteina LBP-3.Senza etichettare con alcuna proteina, la GFP è stata rilevata onnipresente all'interno delle cellule intestinali (Fig. 5a).La fusione LBP-3-RFP, d'altra parte, è stata rilevata all'interno delle cellule intestinali e anche nei celomociti (Fig. 5a), che mostra la secrezione di LBP-3 dall'intestino nella cavità corporea.Abbiamo anche scoperto che questa secrezione di LBP-3-RFP è elevata in lipol-4 Tg (Fig. 5b, c).All'interno delle cellule intestinali, la proteina LBP-3 viene rilevata nel citosol e anche nei lisosomi contrassegnati da LMP-1 e colorati con LysoTracker (Dati estesi Fig. 5a).Inoltre, abbiamo generato ceppi transgenici che sovraesprimono LBP-3 senza il suo segnale secretorio solo nell'intestino e non abbiamo trovato induzione del gene neuropeptidico (Fig. 5d) o estensione della durata della vita (Fig. 5e, Dati estesi Fig. 5b e Tabella 4 supplementare) in questi tensioni.La fusione RFP di questo LBP-3 non secernibile non è stata rilevata nei celomociti (Fig. 5f).Pertanto, la proteina LBP-3 richiede la secrezione dall'intestino per regolare sistematicamente i neuropeptidi e la longevità, che è innescata dalla lipolisi lisosomiale indotta da LIPL-4.a, L'espressione genica di lbp-3 è indicata dalla GFP policistronica, mentre la proteina LBP-3 è visualizzata dalla sua fusione RFP.La fusione secreta di LBP-3-RFP viene rilevata nei celomociti contrassegnati da punte di freccia.Barre di scala, 30 µm e 10 µm nel riquadro.b, c, Il livello di fusione LBP-3-RFP secreta è aumentato di lipol-4 Tg.Le proteine ​​di fusione LBP-3-RFP secrete nei celomociti sono contrassegnate da punte di freccia (b) e i loro livelli sono quantificati in Lipl-4 Tg rispetto a WT (c).Barra della scala, 10 µm.Immagini rappresentative da tre ripetizioni biologiche.d, la sovraespressione specifica dell'intestino di lbp-3ns, che non porta la sequenza del segnale secretorio, diminuisce l'espressione dei geni neuropeptidi.e, la sovraespressione specifica dell'intestino di lbp-3ns non riesce a prolungare la durata della vita.f, la fusione RFP della proteina LBP-3ns non viene rilevata nei celomociti, contrassegnati da punte di freccia.Barra della scala, 10 µm.In c, le barre di errore rappresentano la media ± sem, n = 11 (WT) e n = 15 (lipl-4 Tg) campioni biologicamente indipendenti, ****P <0,0001 dal test t di Student a due code.In d, le barre di errore rappresentano la media ± sem, n = 4 campioni biologicamente indipendenti, ****P <0,0001 mediante ANOVA a due vie con correzione Holm-Sidak ~ 2.000 vermi per replica.In e, n = 3 campioni biologicamente indipendenti;NS, P > 0,05 per log-rank test, 75–100 worm per replica.La durata della vita di un ceppo transgenico è mostrata e gli altri sono nei dati estesi Fig. 5. Vedere la tabella supplementare 4 per i dati sulla durata della vita completa.I dati numerici di origine sono disponibili nei dati di origine.Per esaminare come specifici PUFA e LBP-3 si coordinano tra loro, abbiamo prima esaminato l'effetto dei PUFA sulla secrezione di LBP-3.Abbiamo usato l'RNAi grasso-3 per ridurre la biosintesi dei PUFA nei tessuti periferici e abbiamo riscontrato una riduzione della secrezione di LBP-3-RFP in lipl-4 Tg (Fig. 6a, b).Pertanto, l'induzione di PUFA da parte di lipol-4 Tg promuove la secrezione di LBP-3 dall'intestino.È noto che il mutante fat-3(lf) manca di PUFA a 20 atomi di carbonio, inclusi 𝜔 -6 DGLA e acido arachidonico (AA) che sono indotti da lipol-4 Tg e 𝜔 -3 acido eicosapentaenoico (EPA) e acido eicosatetraenoico ( ETA) senza induzione (Fig. 3a).Abbiamo quindi testato se LBP-3 si lega a DGLA, AA, EPA ed ETA utilizzando un test di legame competitivo basato sulla fluorescenza.In questo test, quando legato a LBP-3, l'acido anfipatico 1-anilinonaftalene-8-solfonico (1,8-ANS) mostra una maggiore fluorescenza che viene spenta una volta superata dagli FFA.Abbiamo scoperto che DGLA (Kd = 10,96 μM), AA (Kd = 2,9 μM) ed EPA (Kd = 4,76 μM) ma non ETA si legano a LBP-3 (Fig. 6c).a, b, In condizioni di WT, la secrezione di LBP-3–RFP non è influenzata dal knockdown di grasso-3 RNAi.Tuttavia, l'aumentata secrezione della fusione LBP-3-RFP da parte di lipol-4 Tg è soppressa dal knockdown del grasso-3 RNAi.Le proteine ​​di fusione LBP-3-RFP secrete nei celomociti sono contrassegnate da punte di freccia (a) e i loro livelli sono quantificati (b).Barra della scala, 10 µm.Immagini rappresentative di tre ripetizioni biologiche (a).c, i segnali di fluorescenza derivati ​​da 1,8-ANS legati a LBP-3 sono ridotti, quando 1,8-ANS è superato dalla quantità crescente (M, molare) di AA, DGLA ed EPA, ma non ETA.d, L'integrazione di DGLA ma non di AA o EPA ripristina l'induzione trascrizionale di egl-3 ed egl-21 da parte di lipl-4 Tg nel mutante fat-3(lf).DMSO funge da controllo del veicolo.e, f, l'integrazione di DGLA ripristina la secrezione di LBP-3-RFP in lipol-4 Tg con knockdown di grasso-3 RNAi.Le proteine ​​LBP-3-RFP secrete nei celomociti sono contrassegnate da punte di freccia (e) e i loro livelli sono quantificati (f).Barra della scala, 10 µm.Immagini rappresentative da tre ripetizioni biologiche (e).g, la supplementazione di DGLA ripristina l'estensione della durata della vita in Lipl-4 Tg con knockdown di grasso-3 RNAi.In b, le barre di errore rappresentano la media ± sem, n = 10 campioni biologicamente indipendenti, *** P < 0, 001 e **** P < 0, 0001 mediante ANOVA unidirezionale con correzione Holm-Sidak.In c, n = 16 replicati biologici, Fit Ki in un sito, R2 = 0,9945 per AA, R2 = 0,9954 per DGLA, R2 = 0,9903 per EPA e R2 = 0,04758 per ETA.In d, le barre di errore rappresentano la media ± sem, n = 5 (lipl-4 Tg; grasso-3(lf) su EV, AA e EPA) e n = 8 (lipl-4 Tg; grasso-3(lf) su DGLA ) campioni biologicamente indipendenti, **P = 0,009 per AA e P = 0,008 per DGLA, ****P <0,0001 mediante ANOVA a due vie con correzione Holm-Sidak, ~2.000 vermi per replica.In f, le barre di errore rappresentano la media ± sem, n = 12 campioni biologicamente indipendenti, ****P <0,0001 mediante ANOVA unidirezionale con correzione Holm-Sidak.In g, n = 3 campioni biologicamente indipendenti, P < 0,001 per log-rank test, 80-100 vermi per replicato.Vedere la tabella supplementare 5 per i dati sulla durata della vita completa.I dati numerici di origine sono disponibili nei dati di origine.Successivamente, abbiamo integrato DGLA, AA o EPA ai vermi e misurato l'espressione genica dei neuropeptidi.Abbiamo scoperto che, in fat-3 (lf), l'integrazione di DGLA è in grado di ripristinare la sovraregolazione dei geni neuropeptidi causati da lipol-4 Tg (Fig. 6d).Né l'integrazione con AA né con EPA mostrano tale capacità (Fig. 6d).Per esaminare la specificità tissutale di questo restauro, abbiamo condotto l'analisi qRT-PCR utilizzando l'intestino sezionato e abbiamo scoperto che l'integrazione di DGLA non provoca induzione intestinale di egl-3 o egl-21 (dati estesi Fig. 6a).Abbiamo anche ripreso le trascrizioni dell'RNA messaggero egl-21 usando smFISH e abbiamo riscontrato un aumento dei neuroni mediante l'integrazione di DGLA (Dati estesi Fig. 6b).Inoltre, l'integrazione di DGLA ripristina sufficientemente l'aumento della secrezione di LBP-3-RFP (Fig. 6e, f) e l'estensione della durata della vita in Lipl-4 Tg con inattivazione di grasso-3 (Fig. 6g e Tabella 5 supplementare).Insieme, questi risultati suggeriscono che l'induzione di DGLA mediante lipolisi lisosomiale promuove la secrezione del chaperone lipidico LBP-3 dall'intestino e segnali LBP-3-DGLA ai neuroni per regolare i neuropeptidi e la longevità.Per confermare ulteriormente che l'effetto di DGLA sui neuroni dipende da LBP-3, abbiamo integrato DGLA a lipl-4 Tg con entrambi i mutanti fat-3(lf) e lbp-3(lf).Abbiamo scoperto che, in assenza di LBP-3, la supplementazione di DGLA non riesce a ripristinare l'induzione del gene del neuropeptide (Fig. 7a).Pertanto, DGLA richiede LBP-3 per regolare i neuropeptidi.Successivamente, abbiamo testato se la specificità del legame lipidico di LBP-3 è responsabile dei suoi effetti regolatori.Nonostante la stretta omologia tra LBP-2 e LBP-3, LBP-2 non è richiesto per la sovraregolazione dei geni neuropeptidi in lipl-4 Tg (Fig. 4a) e la sua sovraespressione non induce geni neuropeptidi (Fig. 7b).Abbiamo quindi analizzato le loro preferenze di legame lipidico attraverso la profilazione del liposoma di C. elegans che si lega a LBP-2 o LBP-3.Abbiamo scoperto che LBP-2 e LBP-3 mostrano preferenze di legame lipidico distinte (Fig. 7c e Dati estesi Fig. 7a).In particolare, DGLA mostra un'occupazione del 25% tra i PUFA legati a LBP-3, ma solo l'1% di occupazione tra i PUFA legati a LBP-2 (Fig. 7c).È interessante notare che per l'EPA, i PUFA più abbondanti nel liposoma di C. elegans (Fig. 7d), sia LBP-2 che LBP-3 mostrano una bassa percentuale di occupazione (rispettivamente 6% e 3%) (Fig. 7c).Questi risultati suggeriscono che LBP-2 e LBP-3 hanno una specificità di legame diversa nei confronti dei PUFA.a, la supplementazione di DGLA non riesce a ripristinare l'induzione di egl-3 ed egl-21 da parte di lipl-4 Tg nello sfondo del doppio mutante grasso-3 (lf) e lbp-3 (lf).DMSO funge da controllo del veicolo.b, l'espressione costitutiva di lbp-2 (lbp-2 Tg) non influisce sulla trascrizione di egl-3 o egl-21.c, Dopo l'incubazione con liposoma C. elegans, gli acidi grassi legati alle proteine ​​LBP-2 o LBP-3 sono stati analizzati con spettrometria di massa.DGLA mostra un'alta percentuale di occupazione in LBP-3 ma non in LBP-2.d, Nel liposoma C. elegans, la percentuale di EPA è più di dieci volte superiore a quella di DGLA o AA.e, strutture di sovrapposizione LBP-2 (blu) e LBP-3 (grigio) previste utilizzando AlphaFold2.f, Un allineamento proteico LBP-2 e LBP-3 generato utilizzando t-caffè.Le strutture secondarie vengono visualizzate sopra il tracciato.La sequenza LBP-2 utilizzata per la sostituzione nella proteina chimerica LBP-3 è evidenziata in viola.g, h, la sovraespressione specifica dell'intestino della chimerica lbp-3(chim) non influisce sulla trascrizione di egl-3 ed egl-21 (g) né prolunga la durata della vita (h).In aeb, le barre di errore rappresentano la media ± sem, n = 3 campioni biologicamente indipendenti;NS, P > 0,05 per ANOVA a due vie con correzione Holm-Sidak, ~ 2.000 vermi per replica.In c e d, n = 3 campioni biologicamente indipendenti.In g, le barre di errore rappresentano la media ± sem, n = 4 campioni biologicamente indipendenti;NS, P > 0,05 per ANOVA a due vie con correzione Holm-Sidak, ~ 2.000 vermi per replica.In h, n = 3 campioni biologicamente indipendenti;NS, P > 0,05 per log-rank test, 98–120 worm per replica.Vedere la tabella supplementare 4 per i dati sulla durata della vita completa.I dati numerici di origine sono disponibili nei dati di origine.Successivamente, abbiamo confrontato le strutture previste di LBP-2 e LBP-3 usando AlphaFold2 e abbiamo trovato cambiamenti in due eliche α simili a cap che sono responsabili del legame lipidico (Fig. 7e).Un allineamento di sequenza tra LBP-2 e LBP-3 rivela che dieci amminoacidi sono diversi in queste regioni (Fig. 7f).Abbiamo quindi progettato una proteina chimerica sostituendo le due eliche α LBP-3 a forma di cappuccio da N38 a K60 con quelle presenti in LBP-2 (Fig. 7f e Dati estesi Fig. 7b).Abbiamo generato linee transgeniche che esprimono questa proteina chimerica selettivamente nell'intestino e abbiamo confermato che la proteina chimerica si esprime normalmente (dati estesi Fig. 7c).Abbiamo scoperto che la sovraespressione della proteina chimerica, come LBP-2, non induce l'espressione genica del neuropeptide (Fig. 7g e Dati estesi Fig. 7d).Nessuna estensione della durata della vita è stata rilevata nemmeno in questi ceppi transgenici (Fig. 7h, Dati estesi Fig. 7e e Tabella 4 supplementare).Questi risultati suggeriscono che la specificità del legame lipidico di LBP-3 nei confronti del DGLA è necessaria per la sua regolazione dei neuropeptidi e della longevità.Per esaminare se l'LBP-3 secreto viene assorbito dai neuroni, abbiamo generato un ceppo transgenico che esprime specificamente il nanobody GFP (GBP) nei neuroni insieme a mKate policistronico, e quindi lo abbiamo incrociato con un ceppo transgenico che esprime LBP-3 fuso con GFP solo in l'intestino.In questa linea, se le proteine ​​​​LBP-3-GFP secrete dall'intestino vengono assorbite dai neuroni, il GBP neuronale le catturerà, rendendo visibile la GFP nei neuroni (Fig. 8a).Dev.J. Neurosci.J. Biol.Chimica.Proc.Natl Acad.Sci.Davanti.Farma.Proc.Natl Acad.Sci.Nat.Rev. Drug Discov.Dev.Nat.Rev. Endocrinolo.Mol.Farma.PLoS Genet.PLoS Biol.PLoS Genet.Dev.Biochim.Biofis.et al.Mol.Cellula.Biol.Nat.Comune.Nat.Comune.Può.Anale.Chimica.et al.Chiunque condivida il seguente link potrà leggere questo contenuto:Spiacenti, un link condivisibile non è attualmente disponibile per questo articolo.Fornito dall'iniziativa di condivisione dei contenuti Springer Nature SharedIt